Oleosomas de semillas de Jatropha curcas L. como estimadores de diversidad en poblaciones del Sur de México

M.L. Adriano-Anaya, J.A. Gómez-Pérez, S. Ruiz-González, J.A. Vázquez-Ovando, M. Salvador-Figueroa e I. Ovando-Medina^*

Centro de Biociencias, Universidad Autónoma de Chiapas. Carretera a Puerto Madero Km 2.0, Tapachula, Chiapas. C.P. 30700. Tel. y Fax: +52 (962) 6427972

*Corresponding author: isidro.ovando@unach.mx

1. INTRODUCCIÓNTOP

Los aceites vegetales son productos agroindustriales de importancia para muchos países, debido a que tienen aplicaciones alimentarias, cosméticas, industriales y energéticas (Chiappella, 2008). Su volumen de producción anual oscila alrededor de 179 millones de toneladas, siendo el aceite de soya el más producido (30.8%; FAO, 2011).

Los aceites vegetales son triglicéridos, con una cadena principal de glicerol invariable en su estructura, pero con cadenas laterales de ácidos grasos que varían considerablemente dependiendo de la especie de donde se extraen (Moreno, 1996).

Los lípidos se acumulan sobre todo en semillas y frutos, pero en ocasiones se encuentran también en cantidades importantes en rizomas y otros órganos subterráneos. Con el fin de almacenar dichos triglicéridos, las plantas han desarrollado compartimientos de almacenamiento, que van de 1 a 10 micrómetros de diámetro, conocidas como “cuerpos de aceites”, “oleosomas”, “órganos de lípidos” y “esferosomas” (Moreau et al., 1980; Huang, 1994; Cardinali et al., 2010). Se ha sugerido que los oleosomas surgen por la acumulación de aceite entre los fosfolípidos del retículo endoplasmático rugoso (Beaudoin et al., 1999) aunque también se ha reportado que se forman en el citosol (Dutta et al., 1991).

Los oleosomas en las semillas son en su mayoría de 0.2 a 2.0 μm de diámetro (Taiz y Zeiger, 2006; Kapchie et al., 2008), aunque el tamaño puede variar entre las especies, por ejemplo, en semillas de soya miden entre 0.2 y 0.5 μm de diámetro y en Cuphea glutinosa oscila entre 1.6 y 3.5 μm de diámetro (Cardinali et al., 2010). Existen estudios que demuestran que los oleosomas son similares en semillas de canola y maíz (Millichip et al., 1996).

Entre las plantas oleaginosas de origen forestal, Jatropha curcas L. tiene un inmenso potencial para la producción de agroenergéticos, ya que el aceite de sus semillas puede ser transformado en biodiesel mediante un proceso de transesterificación (Jongschaap et al., 2007). La semilla de J. curcas contiene entre 12% y 44% de aceite no comestible por población y entre 8% y 54% por individuo (Ovando-Medina et al., 2011). El cultivo sustentable de J. curcas no interfiere con la producción de alimentos (Ovando-Medina et al., 2009), por lo que es una opción viable en proyectos de energías renovables al ofrecer ventajas adicionales sobre otros cultivos (Kheira y Atta, 2009).

Las especies del género Jatropha presentan gran variabilidad morfológica, ya que se ha encontrado que generalmente plantas de la misma zona climática muestran diferencias morfológicas, en la forma y tamaño de las semillas, así como en su contenido de proteínas y lípidos (Martínez et al., 2010; Ovando-Medina et al., 2011).

Existen trabajos que reportan variaciones morfológicas entre accesiones, como la altura de la planta, el número de ramas, el tamaño de hojas, frutos y semillas (Heller et al., 1996), aunque se reconoce que además de las variaciones en el genotipo, las diferencias se deben al ambiente en que se encuentran las plantas. Los estudios de acumulación de aceite en las células de J. curcas se han centrado sobre todo en la variabilidad de las proteínas que forman la membrana de los oleosomas, llamadas oleosinas (Popluechai et al., 2011), mientras que no se ha dado atención a los oleosomas por sí mismos.

A pesar del creciente cuerpo de conocimiento sobre J. curcas, son pocos los estudios sobre la diversidad fenotípica y genotípica en poblaciones mesoamericanas, por lo que se requiere evaluar dicho germoplasma, ya que es una especie nativa de Mesoamérica. Dados los antecedentes sobre variabilidad en el contenido y calidad del aceite de la semilla en poblaciones de J. curcas del Sur de México (Ovando-Medina et al., 2011), se espera encontrar alta variabilidad en el número, tamaño y morfología de oleosomas en dichas poblaciones, por lo que en el presente trabajo de investigación se evaluó la variabilidad en oleosomas de poblaciones de J. curcas del Sur de México.

2. MATERIALES Y MÉTODOSTOP

2.1. Material biológicoTOP

Las semillas se colectaron en el Banco de Germoplasma de Jatropha del Centro de Biociencias de la Universidad Autónoma de Chiapas, ubicado en el municipio de Tapachula, Chiapas, Mexico (14.4976 N, 92.4774 O, 58 msnm). La temperatura promedio anual del sitio fue de 30.7 °C, la humedad media anual 80%, la lluvia total fue de 2632 mm (estación meteorológica: 769043 MMTP) y el suelo fue de tipo andosol. La recolección se realizó de agosto de 2011 a junio de 2012. Se tomaron 5 semillas de frutos en madurez comercial (color amarillo) de cada accesión, a las cuales se les retiró la testa dejando el endocarpio al descubierto (Tabla 1).

2.2. Análisis histológico de oleosomasTOP

Las semillas se utilizaron para realizar un estudio histológico de oleosomas, siguiendo las técnicas de preparación y corte en micrótomo para especies vegetales de Molist et al. (2011), modificando los tiempos en la deshidratación y en la inclusión en parafina, al igual que las concentraciones de colorantes y soluciones utilizadas.

2.3. Fijación e infiltraciónTOP

El proceso de fijación se realizó con formaldehído - alcohol etílico - ácido acético - agua (FAA en relación de volúmenes 5:3:1:1) por un mínimo de 72 horas y un máximo de una semana. Posteriormente, los tejidos se deshidrataron en una serie de soluciones de alcohol etílico de 10, 25, 50, 75 y 96 grados Gay-Lussac. En cada solución se mantuvieron por 8 horas. A continuación, los tejidos se embebieron en xilol, para lo cual se sumergieron en una serie de soluciones de xilol diluido en alcohol etílico a concentraciones de 10%, 25%, 50%, 75% y 100%, con un tiempo de sumersión de 3 horas en cada concentración. Posteriormente se infiltró parafina histológica (Paraplast McKormick^®, 2 μm) en los tejidos mediante inmersión por 24 horas a 60 °C.

2.4. Incrustación y cortesTOP

Para realizar los cortes con micrótomo se incrustó la muestra preparada en parafina de tal manera que adquiriera forma de cubo (3 cm×2 cm×1.5 cm). Se procedió al montaje y corte en un micrótomo de rotación (Microm^® HM 315), obteniendo cortes con grosor de 5 μm.

2.5. Montaje, tinción y observación microscópicaTOP

Para la observación microscópica de la muestra se montaron los cortes en portaobjetos y se cubrieron con solución de alcohol etílico - acetona (5:3 v/v) para desprender la parafina. Una vez fijada la muestra se procedió a teñir con p-fenilendiamina (Sigma-Aldrich^®) al 4% durante 45 min, posteriormente se hizo un lavado con alcohol etílico y agua. Se utilizó el colorante Sudan III (Meyer^®) durante 6 min para teñir los oleosomas, seguido de un lavado con alcohol etílico y agua. Para obtener contraste se tiñó con azul de metileno durante 5 min, seguido de un lavado con agua. Para obtener preparaciones permanentes se colocó una gota de bálsamo de Canadá sobre el tejido, se calentó ligeramente a la flama y se colocó un cubreobjetos. Las observaciones al microscopio se hicieron con 1000 aumentos y se tomaron microfotografías de campos visuales de 0.005 mm² de área, utilizando el analizador de imágenes AxioVisionLE^© (Carl Zeiss^®) acoplado a un microscopio Axiolab^® (Carl Zeiss^®).

2.6. Análisis de heredabilidadTOP

Para conocer el grado de heredabilidad de caracteres de los oleosomas, se seleccionaron semillas almacenadas (colectadas en 2010) de 20 accesiones al azar, las cuales se sometieron al mismo proceso de preparación, corte y observación microscópica. Los datos obtenidos se compararon con los datos de las semillas colectadas en 2011.

2.7. Análisis de datosTOP

A partir de las microfotografías se registraron las variables: número de oleosomas por célula, tamaño medio de oleosomas y tipo de arreglo de los oleosomas. Por otra parte, se usaron los datos de área del campo visual microscópico (0.005 mm²) y el grosor de los cortes de tejidos (5 μm) para calcular el volumen estudiado (2.5×10⁻⁵ mm³ ó μL) y con ello estimar el número de oleosomas·μL de tejido⁻¹, número de células·μL de tejido⁻¹. Además, considerando a los oleosomas como esferas perfectas, se usaron los radios promedio para estimar el volumen (V = 4/3πr³) de oleosomas. Este dato se multiplicó por el número de oleosomas·μL de tejido⁻¹ para obtener la relación oleosomas/tejido (V/V). Los datos fueron vertidos en una matriz del programa Excel©, se obtuvieron las estadísticas descriptivas y se realizó una prueba de normalidad de Anderson-Darling (α 0.05).

Se transformaron los datos con base en una escala de 1 a 15, utilizando los rangos de clase calculados a partir de los datos crudos. Los datos fueron procesados mediante análisis multivariado discriminante por población, en el cual se colocaron los caracteres tomados para el estudio y se agruparon en poblaciones. Para visualizar las relaciones entre los individuos se realizó un análisis de conglomerados empleando distancias de Manhattan y el método de agrupación de Ward. En ambos análisis se siguieron dos vías, en la primera se utilizaron todas las poblaciones y en la segunda solo las poblaciones pertenecientes a Chiapas.

Utilizando los datos crudos, se realizaron análisis de varianza para conocer las diferencias en las variables más importantes entre individuos y entre poblaciones. Con los datos de contenido de aceite reportados por Ovando-Medina et al. (2011) para las mismas accesiones, se realizó un análisis de correlación (Pearson α 0.05) entre esa variable y los datos de oleosomas. Para todos los análisis anteriores se utilizó el programa XLStat© versión 2012.

Para el estudio de heredabilidad se arreglaron los datos en forma de multi-temporada con multi-genotipos y se analizó la variación genotípica, fenotípica y la heredabilidad en sentido amplio (h²_bs), utilizando el programa PBStat© versión 1.2 (Bayuardi-Suwarno et al., 2008).

3. RESULTADOSTOP

3.1. Variación en el tamaño, número y arreglo de oleosomasTOP

En el estudio se observó la presencia de oleosomas esféricos, con tamaños que oscilaron entre 2.18 μm y 4.15 μm de diámetro. Los datos siguieron una distribución normal (prueba de Anderson-Darling A²=0.641, p=0.091), siendo el rango de tamaños de 2.784 μm a 2.984 μm el más frecuente (Figura 1).

En los análisis de contribución a la varianza total mostró que las variables oleosomas por célula y tamaño de oleosoma fueron las más informativas en los factores 1 y 2, respectivamente. El análisis de varianza por individuo mostró que la accesión MAP-6 tiene el mayor número de oleosomas por célula (22.01), siendo estadísticamente distinta y superior al resto de las 85 accesiones (Tabla 2, Figura 2a). Por su parte, la accesión ARR-7 (9.17, Figura 2b), y ARR-11 (9.36, Figura 2c) presentaron el menor número de oleosomas por célula (Tabla 2). La accesión con oleosomas más grandes (4.15 μm) fue PIJ-2 (Tabla 2, Figura 2d), mientras que las accesiones HUX-7 (2.1 μm, Figura 2e) y ECO-6 (2.2 μm, Figura 2f) tienen los oleosomas más pequeños (Tabla 2).

En el estudio por población, el análisis estadístico mostró que J. curcas de Veracruz cuenta con los oleosomas de mayor tamaño (3.31±0.14 μm) y la población Oaxaca tiene los oleosomas más pequeños (2.48±0.22 μm). Por otra parte, la población Soconusco tiene el mayor número de oleosomas por célula (15.98±2.92), mientras que la población que cuenta con el menor número de oleosomas por célula (13.18±1.06) es Frailesca. Se encontró que la población Oaxaca tuvo menor número de células·μL de tejido⁻¹ (4.733×10⁵) que el resto de poblaciones. Respecto al número de oleosomas·μL de tejido⁻¹, la población Soconusco (8.355×10⁶) fue estadísticamente superior a las demás poblaciones (Tabla 3).

Los oleosomas se presentaron en dos tipos de arreglo espacial: dispersos y agrupados (Figura 3). De un total de 85 genotipos estudiados, 44 presentaron oleosomas con arreglo agrupado, mientras que los 41 restantes tienen arreglo disperso. Las accesiones de las poblaciones Soconusco, Oaxaca y Veracruz presentaron oleosomas con arreglo exclusivamente agrupado, los individuos de la población Centro presentaron solo arreglo disperso y en las poblaciones Istmo, Frailesca, Frontera y Guatemala no se encontró un patrón único de arreglo de los oleosomas.

3.2. Análisis discriminante de accesiones basado en oleosomasTOP

Para el primer análisis se utilizaron todos los genotipos de J. curcas del Sur de México, mediante el cual se encontró que el componente principal 1 (F1), que es el más importante, explicó 57.65% de la variación total y la variable que más contribuyó al F1 fue el tamaño de oleosomas. El componente principal 2 (F2) explicó 34.35% de la varianza, siendo oleosomas·μL de tejido⁻¹ la variable que más aportó a este factor.

En la Figura 4, se muestra el patrón de agrupación de las accesiones de 8 poblaciones, de acuerdo al F1 y F2, los cuales explican en conjunto el 92% de la varianza. Se observa que las accesiones que pertenecen a las poblaciones de Oaxaca y Veracruz se agrupan hacia el F1, mientras que las accesiones que pertenecen a las poblaciones de Soconusco e Istmo se agrupan en el F2. Para visualizar la relación entre poblaciones, se graficaron los centroides, los cuales se muestran en la Figura 5. Se observa como la población de Oaxaca se separa claramente del resto de poblaciones, y en menor medida, Soconusco y Veracruz, mientras que el resto tienen centroides traslapados. Además se puede observar que la población Istmo es la más diversa.

El segundo análisis discriminante estudió exclusivamente las accesiones del Estado de Chiapas, debido a que en dicho lugar existe mayor extensión de cultivo tradicional de J. curcas. En el análisis, el componente principal 1 (F1a), que es el más importante, explicó 61.13% de la variación total y la variable que más aportó a la varianza del F1a fue oleosomas por célula. El componente principal 2 (F2a) explicó 35.19% de la variación, siendo la variable tamaño de oleosoma la más informativa. Se observa que las accesiones que pertenecen a la población de Soconusco e Istmo se agrupan hacia el F1a, mientras que las accesiones de la población Frailesca y Frontera se agrupan en el F2a (Figura 6). Para visualizar la relación entre poblaciones, se graficaron los centroides, los cuales se muestran en la Figura 7, donde se observa que la población Soconusco se separa, mientras que el resto tienen centroides traslapados. Se observa que la población Istmo es la más diversa.

3.3. Análisis de conglomerados basado en oleosomasTOP

Se realizaron dos análisis de clasificación ascendente jerárquica, en el primer análisis se emplearon 85 accesiones del Sur de México, dando como resultado la formación de nueve grupos (considerando la línea de formación de grupos a una disimilitud de 8%; Figura 8). El porcentaje de variación dentro de los grupos fue de 35.03%, mientras que entre grupos fue de 64.97%, es decir la varianza entre los grupos es mayor. Existe un grupo de cinco accesiones (MAP-8, MAP-7, MAP-6, PIJ-5 y HUX-7), todas pertenecientes a la población Soconusco, estas se separan del resto de los individuos formando un grupo con 19% de disimilitud con respecto a las demás accesiones. En el resto de grupos no se observó correlación con su origen geográfico.

El segundo análisis se realizó con 71 genotipos, los cuales pertenecen a Chiapas, en este se observa la formación de 14 grupos, considerando la línea de formación de grupos a una disimilitud de 7.4%. El porcentaje de variación dentro de los grupos fue de 23.36%, mientras que entre grupos fue de 76.64%, es decir la varianza entre los grupos es mayor. Se observan grupos con un solo individuo (CAC-3, CAC-5, MAP-7, PIJ-2 y TON-2), que, exceptuando a CAC-3, están relacionados entre ellos y pertenecen a poblaciones de la Costa de Chiapas. En general, no existió agrupación de acuerdo al origen geográfico, excepto por el grupo 1 (ARR-16, ARR-11, ARR-3, VCO-3, VCO-2, ARR-7 y ACA-5), el cual contiene a la mayoría de los individuos de la población Istmo (Figura 9).

3.4. Análisis de heredabilidadTOP

El estudio de las variables con datos de dos años consecutivos mostró un porcentaje muy alto de heredabilidad en sentido amplio de los caracteres oleosomas·μL de tejido⁻¹ (h²_bs=94.3%) y oleosomas por célula (h²_bs=92.2%). En el caso de la variable tamaño de oleosoma no pudo calcularse la heredabilidad, debido a que, aunque existió variación fenotípica, no hubo variación genotípica (Tabla 4).

3.5. Análisis de correlaciónTOP

No se encontró correlación (p>0.05) entre las matrices con los datos individuales de oleosomas y las matrices con los datos de cantidad de aceite de la semilla. Sin embargo, la variable emergente relación oleosomas/tejido (% volumen/volumen) presentó correlación estadísticamente significativa y positiva con el contenido de aceite de la semilla determinado por el método de extracción con solventes (Figura 10).

4. DISCUSIÓNTOP

J. curcas es una planta cuyo más probable centro de origen es Mesoamérica (Carels, 2009; Ovando-Medina et al., 2013; Sunil et al., 2013) y es considerada en proceso de domesticación (Achten et al., 2010; Carels, 2013), lo cual, junto con el hecho que en la región mesoamericana es propagada casi exclusivamente por medios vegetativos, podría significar que sus poblaciones tienen baja diversidad. Sin embargo, en varios estudios recientes se ha mostrado que existe alta variabilidad tanto genotípica, detectada con marcadores moleculares (Ovando-Medina et al., 2011; Magaña-Ramos, 2013; Chikara et al., 2013), como fenotípica (Ovando-Medina et al., 2011; Pérez-Castillo, 2012). El hecho que las características de oleosomas presenten altos niveles de heredabilidad (Tabla 4) indica que se trata de caracteres conservados y permite su utilización como estimadores de diversidad genética. Esta es la primera vez que se utilizan datos de oleosomas de la semilla para estimar la variabilidad poblacional en esta especie.

Aunque en los últimos diez años se ha incrementado sustancialmente el número de investigaciones con la planta J. curcas (Achten et al., 2010; Carels, 2013), impulsado por el interés en la obtención de materia prima para fabricar biocombustibles, se ha dado poca atención al estudio microscópico de los oleosomas de la semilla. Los estudios de proteómica de los oleosomas de J. curcas son abundantes (Hui et al., 2009; Ming-Feng et al., 2009; Mao-Sheng et al., 2011; Popluechai et al., 2011), sin embargo, solo dos reportes se enfocaron en el análisis de los oleosomas por sí mismos (Gu et al., 2012; Ishii et al., 2013).

Los hallazgos mostraron que los oleosomas de J. curcas del sur de México son esféricos con tamaños que varían entre 1 y 4 μm (Figura 1), lo cual constrasta con lo reportado por Ishii et al. (2013), quienes estudiaron plantas de J. curcas colectada en Filipinas encontrando oleosomas con rango de tamaños de 1 a 12 μm. Si se toma en cuenta el tamaño máximo reportado por esos autores, habría solamente dos oleosomas por célula considerando que el tamaño de las células de J. curcas es de 24 μm de diámetro en promedio. Por otra parte, se ha reportado que la diversidad de esta especie en poblaciones de Asia es baja, estimada tanto por marcadores moleculares (Mao-Sheng et al., 2011; Xu et al., 2011), como morfológicos (Sujatha y Mukta, 1996; Yu et al., 2010), por lo que resulta sorprendente que el rango de tamaños de los oleosomas de plantas colectadas en Filipinas sea más amplio que lo encontrado en poblaciones mesoamericanas.

Tanto los análisis de varianza por carácter individual (Tablas 2 y 3), como los análisis multivariados mostraron alta variabilidad en las accesiones evaluadas, lo cual se puede verificar por la elevada dispersión de puntos en los gráficos bidimensionales de los análisis de discriminante (Figuras 4 y 6) y por los altos índices de disimilitud entre individuos en los análisis de conglomerados (Figuras 8 y 9). Lo anterior concuerda con la alta diversidad encontrada en poblaciones de J. curcas de México (Basha et al., 2009), en particular de Chiapas (Ovando-Medina et al., 2011; Pecina et al., 2011), así como de Guatemala (Azurdia et al., 2008).

Los análisis por accesiones individuales no mostraron agrupación congruente con el origen geográfico, lo cual coincide con lo encontrado por Sánchez-Gutiérrez (2010) y Pérez-Castillo (2012), quienes utilizaron las mismas accesiones que en el presente estudio. El primer autor estudió la variación molecular por polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés) de J. curcas del estado de Chiapas y el segundo autor estudió la variabilidad floral de J. curcas del sur de México, encontrando ambos, mediante análisis de conglomerados, que las accesiones están agrupadas sin un patrón geográfico.

No obstante lo anterior, el análisis por poblaciones (discriminante) mostró que al menos dos poblaciones están claramente diferenciadas (Veracruz y Soconusco). Esto coincide con los estudios de Ovando-Medina et al. (2013), quienes estudiaron la diversidad genética estimada con AFLPs, microsatélites, ácidos grasos de la semilla y caracteres de la flor, utilizando los mismos genotipos que en este trabajo, encontrando que J. curcas de la población Soconusco está diferenciada con respecto al resto de poblaciones. Es posible que en la región Soconusco los altos niveles de precipitación (hasta 4000 mm) hayan funcionado como factor de selección de los genotipos, los cuales se adaptaron diferenciándose, incluso reproductivamente de otras poblaciones. De los sitios de origen de las accesiones estudiadas ninguno tiene más de 1500 mm de precipitación anual. En el trabajo de Ovando-Medina et al. (2013) no se incluyeron accesiones de Veracruz, por lo que se requieren investigaciones adicionales con los genotipos de esa región.

La correlación encontrada entre obtener la variable emergente relación oleosomas/tejido (% volumen/volumen) y el contenido de aceite medido por el método convencional posibilita la estimación del potencial productivo de accesiones de J. curcas cuando la cantidad disponible de semillas es limitada, como en los programas de mejoramiento genético, donde se obtienen unas cuantas semillas producto de la hibridación interespecífica.

5. CONCLUSIONESTOP

Los caracteres de oleosomas de la semilla de J. curcas tienen alta heredabilidad en sentido amplio por lo que al utilizarlos como estimadores de la diversidad en poblaciones del sur de México revelaron que existe alta variabilidad, con dos poblaciones, Veracruz y Soconusco, diferenciadas del resto evaluado. La relación porcentual volumen de oleosomas por volumen de tejido está correlacionada con la cantidad de aceite acumulada en la semilla. La identificación de accesiones con caracteres contrastantes (valores muy altos y muy bajos) permitirá en futuras investigaciones realizar estudios de la herencia de caracteres en J. curcas, contribuyendo al mejoramiento genético de esta especie para mejorar su producción de aceites.

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